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Western blotting

yamasaki.y: 2002.08.25/2003.01.06

Materials

1. see Materials for Western blot and CBB.

Methods

1. 泳動装置をセット。loading B を注ぐ。
2. ウェルを注射器で洗う。ゲルの下の泡も追い出す。
3. (120 vol) 20 mA / gel。二枚ならば 40 mA。時間はだいたい 60 min くらい。BPB のラインが下から5mmくらいになったら終了。
4. 泳動終了前にPVDF膜をメタノールに浸してから、transfer bufferになじませ、振盪させておく。
5. 泳動終了。ゲル板をはずし、水道水で洗う。
6. スパーテルをすきまに入れてゲル板をゆっくりとはがす。スパーテルでスペーサーとゲルを切り離す。スタッキングゲルも切り離す。ただしゲル板を傷つけないように注意。
7. ゲル板をtransfer bufferの入った容器の上に持ってきて逆さまにし、はがすようにしてゲルを液に落とす。
8. 15分振盪。この間にゲル板と泳動漕を洗う（乾燥させないこと)。泳動漕は水道水ですすいだあとROですすぐ。ゲル板はスポンジに洗剤をつけ、柔らかい面で軽く洗う。スペーサーやノッチの部分にゲルが残っていることがあるので注意。同様にすすいで乾燥棚へ。
9. transfer。下から、濾紙三枚、膜、ゲル、濾紙三枚 (9x6 cm)。気泡が入らないように。(20vol) 100 mA/membrane、40min。
10. この間にblocking buffer を用意。5% skim milk in TBST。stirring しておく。
11. ブロッキング一時間。転写装置はすぐに洗う。
12. TBST でリンス。15min x 3。
13. 一次抗体をTBSTで希釈。
14. ペーパータオルで余分な液を除いた後、メンブレンをパックに挟み、三方をシールする。
15. 抗体を加えてシールし、よく混ぜる。4'C o/n。泡が membrane に重なっていないようにする。
16. TBST リンス。15 min x 4。
17. 二次抗体 (HRP)。だいたい1:10,000希釈くらい (3,000-30,000)。120 min 振盪。
18. 現像機の電源を入れる。
19. TBST リンス。15 min x 4。
20. ECL を用意。6 (3+3) ml/membrane
21. ペーパータオルでメンブレンの余分な液を除く。
22. ECL で 1 min。
23. ペーパータオルでメンブレンの余分な液を除く。
24. ラップする。
25. 暗室でフィルムにコンタクト。
26. 現像。
27. 現像機の電源を切る。

Tips and Comments

• apply は20 ul /well くらいが最大。きれいに流すこつは、バッファ組成とアプライする量をそろえること。