[ index ]

phalloidin stain of embryos (lateral epidermis)

Mizuno T.: 2001.03.08

Introduction

phalloidinは、F(filamentous)-アクチンに特異的に結合する分子であり、その性質を利用して、細胞内のF-アクチンを可視化するためによく用いられる。　F-アクチンは、細胞の表層に集積しているので、phalloidin 染色像は、細胞の形態を表している。　胚のphalloidin stainを行うときは、ビテリン膜をはがすときにメタノールを使えないので、８０％エタノールを使ってはがすか、手ではがす必要がある。　８０％エタノールを使ってはがすことを試みたことがあるが、効率よく行えなかった。　そこで、ここでは、手ではがす方法を書き記す。

Materials

Solutions and Reagents

  1. アップルジュースプレート
  2. 次亜塩素酸ナトリウム（４℃保存、あまり古くなると効きが悪くなる）
  3. 固定液（７.４％ホルムアルデヒド/ＰＢＳ：ヘプタン＝１：１。　使用直前に、水１.４ml、３７％ホルムアルデヒド０.４ml、１０XＰＢＳ０.２ml、ヘプタン２mlをボルテックスで混ぜてつくっている）
  4. PBST（ここでは、１X PBS、０.２％TritonX-100）
  5. PBST/BSA（PBSTに、最終濃度１％になるようにBSAを加える。　BSAが入っているので、一応４℃で保存している。）
  6. rhodamine-phalloidin（Molecular Probe社製。　説明書の通りにメタノールで溶かし、-２０℃保存）
  7. PBST/BSA/phalloidin（PBST/BSAでrhodamine-phalloidinを４０倍に希釈する）
  8. 退色防止剤入りのmountant（冷凍庫に入っているものを使っている）

Method

  1. アップルジュースプレート（５０mlチューブ）で採卵する。

  2. ２５℃、１２時間（通常、プレートを替えてすぐに卵を産み、またすぐに卵を産まなくなるので、AEL１２hrの胚が数多く存在する）。

  3. 胚を絵筆で回収する。

  4. 水で汚れを洗い流す。

  5. 次亜塩素酸ナトリウム（服に付くと、穴が空くので注意すること）でコリオンをはがす。（次亜塩素酸は薄めずに原液を使っている。）

  6. 数分後、実体顕微鏡でコリオンがはがれたことを確認する。　コリオンがはがれるとdorsal appendageがなくなり、胚に光沢がでる。

  7. 水で次亜塩素酸を洗い流す。

  8. 胚を絵筆で回収し、固定液に入れる。

  9. ２０分間ローテーション。

  10. パスツールピペットを使い、固定液を取り除き、PBSTで３〜４回洗う。（ヘプタンが残っているうちは、胚は沈みにくい。）

  11. パスツールピペットで、表面をシリコン化したスライドグラスに胚を移す。

  12. 水分をペーパータオルで取り除く。　胚が乾きすぎるとビテリン膜をはがすときに、胚が壊れやすくなる、というより、ビテリン膜がはがれなくなる。　また、胚が変形してしまう。　水分を残しすぎると、両面テープへの張り付きが弱くなる。

  13. 胚を両面テープに張り付け、胚が上になるように両面テープをスライドに張り付ける。

  14. すぐに胚をPBSTで覆う。

    ここで、遺伝子型を見分けるためのX-gal染色を行うことができる。　しかし染色時間が長すぎると（３時間は駄目だった、３０分では大丈夫であった）、おそらくTritonX-100の影響で、ビテリン膜をはがすときに胚が壊れやすくなる。　二番染色体は、Cyo,wg-lacZ、三番染色体は、TM3,P{ry=HZ2.7}DB2を使っている。

  15. タングステン針で、ビテリン膜をはがす。

  16. 胚を１.５mlチューブに回収する

  17. PBST/BSAでブロッキングする（これ以降、液量は全て０.５mlで行っている）。

  18. ３０分間ローテーション

  19. PBST/BSA/phalloidinで染色する（これ以降、遮光）。

  20. ３０分間ローテーション

  21. PBSTで洗う

  22. １０分間ローテーション　X　３〜４

  23. 退色防止剤入りのmountantでスライドガラスにマウントする。

  24. 共焦点で観察する。