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Immunostaining of imaginal discs

yamasaki.y: 2003.10.02

Materials

• PBS
• PBSTx: PBS + 0.3% Triton-X 100
• 2x PEM (PEM: 0.1M PIPES, 1mM EDTA, 2mM MgSO4)
• 5% BSA/PBSTx: PBSTx に BSA を加え、フィルター滅菌する。4'C 保存。
• 解剖皿(ホールオベクトグラス大型・池本理化工業)

Methods

1. dissect in PBS
2. fix in 3.7% PFA/PEM for 1hr at RT
3. rinse in PBSTx for 10 min at RT x3
4. block in 5% BSA/PBSTx for 30 min at RT
5. 1st Ab o/n at 4'C (or 1 hr at RT)
6. rinse in PBSTx at 4'C (total 60 min)
7. block in 5% BSA/PBSTx for 30 min at 4'C
8. 2nd Ab o/n at 4'C (or 1 hr at RT)
9. rinse in PBSTx at 4'C (total 60 min)
10. (HRP or AP conj. の場合は発色反応)
11. dissect
12. microscope

Tips and Comments

• 解剖したサンプルをいれるチューブは on ice しておく。
• disc は体壁から切りはずさずに染色する。ただし体壁に張り付いているときは浮かせておく。検鏡の前に切り離す。また必要のない組織は除いておく。eye-antenna disc は脳との連結を切り離しておく。
• 固定は 1.5 ml tube で。PFA (Paraformaldehyde) は 37% soln. を作って -20'C stock しておき、直前に解凍して、2x PEM, H2O と混ぜる。
• 液を捨てるときはP200を使った方がやりやすい。
• 抗体反応は節約のため 600 ul PCR tube を使い、200-400 ul で行う。サンプルを移すには、先を切って太くしたチップを使う。
• ポジコン、ネガコン、テクニカルコントロールを適切に行う。
• 適切な抗体濃度がわからないときはとりあえず 1:100 を目安に 1:30, 1:300 などの三点で試してみる。
• はじめて使う二次抗体は、一次抗体を入れずに染色してみる。バックグラウンドが高いようなら absorb してから使う。
• 蛍光抗体の mountant は Vectashield (DAPI 入り) を使っている。