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Mizuno T.: 2002.05.02
Fusion protein, transgenic などの Plasmid construction に応用する。
サーマルサイクラーの電源を入れる。 下記の温度時間条件を入力しておく。
試薬を混ぜる。 試薬を混ぜる順番は、一般的にwater、buffer、enzymeの順番で（これはどんな実験にも適応される）。 まず何種類反応させるかを計算し、その数＋１〜２本分のpre-mixを作製する。
以下は１サンプル当たりの容量
10xBuffer 5 ul dNTP 4 ul templete primer1(5mM) 5 ul （10 mMを2.5 ulや、2 mMを12.5 ulでもよい） primer2(5mM) 5 ul Pyrobest 0.25 ml Water 30 ul（全体量50 ulになるように加える）
templeteとprimerをあらかじめ入れておいた専用チューブにpre-mixを加え、ピペッティングによって混ぜる。 念のために専用遠心機でスピンダウンする。
チューブをサーマルサイクラーにセットする。
94℃ 15sec 55℃ 30sec 70℃ 1min/1kb (5kbであれば5min) これを30サイクル行い、終了後、4℃保存
電気泳動で増幅を確認する。
2種類のプライマーに依存して増幅が起こっているかを確認するために、プライマーを一つしか入れないコントロールを行うこと。 要するに、forward primer 1 と reverse primer 2に依存して増幅しているかを調べるためには、forward primer 1 のみのサンプル、 reverse primer 2 のみのサンプルをコントロールとして行う。
全く増幅が見られないときは、extention time をのばしたり、以下のようなサイクルを試してみる。
94度 1分 98度 20秒 68度 20分 これを14サイクル 98度 20秒 68度 20分＋15秒／サイクル（一サイクル毎に15秒ずつ長くする） これを16サイクル 72度 10分 4度
PCR productを1.5 mlチューブに移し、以下を加える。
PCR product A ul 3M NaOAc A/10 ul EtOH 3A ul
vortexで良く混ぜる。
-２０℃、２０min （この段階で長期保存可能）
１５krpm、４℃、２０min
上清をピペットマンで取り除く。
適量（沈澱させたときの容量より多めに、5A mlとか）の７０％EtOHを沈澱に直接かからないよう静かに加える。
チューブを数回ゆっくりとひっくり返す。
１５krpm、４℃、５min
上清をピペットマンでよく取り除く。
vacuum dry、２min（沈澱が乾燥していることを確認する）
16 ulのwaterに溶解する。
Probest PCR product には 5' 末端にリン酸基がない。 Ligationのためには２つのDNA断片の 5' 末端のどちらかにリン酸基が必要である。 そこでpolynucleotide kinase (PNK) 処理を行い、PCR product 5' 末端にリン酸基を付加する。
エタノール沈澱させたPCR productに以下を加える（全てREVCOのother enzymeの箱に入っているはず）。
10 X PNK buffer 2 ul 20mM ATP 1 ul PNK 1 ul
３７℃、３０min〜（以前行った時は２時間処理したが３０分くらいで大丈夫だと思う）
TAKARAの10 X Loading bufferを加える。（applyの際に沈まないと困るので、いつも1/5量くらい加える）。
0.7%アガロースゲルで電気泳動する。 断片を切り出す場合には、コンタミ防止と切り出し易さを考えて、１レーン置きに泳動している。 また、泳動槽は洗浄し、泳動バッファーは交換する。
dyeがゲルの2/3まで流れたら、泳動を終了させる。
ゲルをEtBr槽に入れて、軽く浸透する。 EtBr槽についても洗浄し、液を新しくする。 液の作り方は、まず容器の半分くらいまで超純水を入れ、そこに泳動コーナーの戸棚に入っている高濃度のEtBrを数十マイクロリッター加える（液がかすかに染まる程度入れる）。 EtBrは変異原なので注意すること。
１０min（この間にゲルから切り出す準備をする）
手袋をして、ゲルをサランラップの上に取り出す。 電気を消す。 防護マスクをかぶる。 ゲルから目的の断片を切り出す（なるべく小さく切り出す）。 切り出したものを1.5mlチューブに入れる。 切り出し終わった後のゲルは捨てる前に写真を撮影しておく。
ゲルの入ったチューブとゲルの入っていないチューブの重さをはかり、ゲルの重さを調べる。
これ以降はQIAEXIIの説明書に従う。 ただし、最終的に20 ulのwaterに溶解する。
REVCOに入っているTOYOBO Ligation Highを溶解する。
以下のサンプルを調合する。 要するに、vectorとinsertの両方に依存しているかを調べる。 QIAEXIIで精製した断片は、ビーズが残存していると良くないので、使用前に遠心すること。
vector 1 ul＋insert 5 ul＋Ligation High 4 ul vector 1 ul＋water 5 ul＋Ligation High 4 ul water 1 ul＋insert 5 ul＋Ligation High 4 ul
１６℃（室温でもかまわない）、overnight
self ligationの場合はDNA 1 ul＋water 5 ul＋Ligation High 4 ulでやって下さい。 あと注意点としては、PCRのtempleteがコンタミしている可能性があるので、DNA 1 ul＋water 9 ulというコントロールを行って下さい。
Pyrobest DNA polymeraseを用いたPCRのproductのcloning用に、pBSKのEcoRV-digestion and BAP-treatment を用意しておく。
ディープフリーザーに入っているコンピテントセルXL-1 blueを室温で溶解する。 １サンプル当たり100ml必要である。
ligation反応後サンプルをスピンダウンする。 基本的に、小型遠心機で遠心できるチューブはふたをあける前にスピンダウンすること。
コンピテントセルを100ml加え、ピペッティングもしくはタッピングで良く混ぜた後、氷上に１５分置く。 残ったコンピテントセルは捨てるか、単なるプラスミドのtransformationに使う。
４２℃、４０秒〜１分、ヒートショック
氷上に戻す。
LBを1ml加え、数回ひっくり返し混ぜる。
３７℃、３０分（インキュベーターに入れるか、ストック箱に入れてシェーカーに入れる）
4krpm、室温、3分で遠心し、菌体を沈澱させる。
上清をデカントで軽く捨てる（100mlくらい液が残るようにする）
菌体をピペティングで溶解する。
LB-amp plateに全量をまく。
スプレッターはまず縦方向にのみ動かし、その後、横方向に動かす。 ここでのポイントは不均一に広げることであり、そうするとtransformantが大量に出現した場合でも、single colonyをpick upすることができる。
37℃、overnight、もしくは、30℃、2overnight
これはligationサンプルのtransformationであり、単にプラスミドをtransformationする場合にこの方法で行うと大量にtransformantが出現してしまう。 それを回避するために次のように行う。 １、使い回しのコンピテントセルを使用し、２、コンピテントセルの量を少なめにし、３、recoveryせずに少量（数マイクロ）まく。 要するに雑に行えば良い。
ミニプレマシーンで行うのであれば、ファイル２か３で行い、乾燥（vacuum dry）と溶解は自分で行う。 注意点は、きちんと乾燥させることと、溶解に用いるTEはRNAの入っていないものにすること（マシーンで行えば、RNAは除去されている）。
多分マシーンの方がきれいに回収できるし、楽ちん。以下に手で行う方法を記す。
作り方はMolecular Cloningに書いてあると思う。注意点は、ampは-２０℃ で凍らせておくことと、solution２は数週間経ったら新しく作りなおすこ と。solution２は、水、アルカリ、SDSの順でいれ、アルカリを入れた後、 SDSを入れる前に、きちんと混ぜないと、SDSを入れたときに沈殿ができる。 LB/amp(50ug/ml)は毎回作るのは面倒なので、作って４℃に保存している。 長く置いておくとampが効かなくなるかもしれないので、１月以内に使って いる。（１月というのも根拠はなく、気分の問題かも。）
シングルコロニーを２mlのLB/amp(50ug/ml)に植菌する。入れ物は試験管もしく は使い捨てのプラスチックチューブを使う。
３７℃で一晩振盪培養。
培養液を１.５mlチューブに移す（入るだけ入れる）。
１５krpm、４℃（あまり気にしていない）、１min。
上清をデカントで出来るだけ捨てる。
petを１００ulのSolution１にボルテックスで溶かす。
２００ulのSolution２を加え、４、５回ひっくり返して混ぜる。この操作によって、大腸菌の細胞膜が壊れ、菌体内のプラスミドが外に出てくる。激しく振りすぎると、細胞膜にくっついている大腸菌のゲノムDNAが出てきてしまうので良くない。この操作から９番の操作までは５分以内でやること。そうしないとプラスミドがアルカリによって変性してしまい、精製後の処理が効きにくくなる（制限酵素で切れにくくなるなど）。
蓋を開けると、アルカリとSDSで大腸菌の細胞膜が壊れて、蛋白質が溶出したために、糸を引いている。
１５０ulの５M KoAcを加え、再度４、５回ひっくり返して混ぜる。この操作によって、pHが中性に戻り、膜や蛋白質が塩析する（白い塊が見えるようになる）。
１５krpm、４℃、１０〜１５min（時間は気分次第）
sup４００ulを別の１.５mlチューブに移す。
supに１ml（2.5倍量）のエタノールを加え、ボルテックスする。
１５krpm、４℃、５min（長く遠心しすぎると余分なものも沈殿するかも）
supをデカントで出来るだけ捨てる。
１mlの７０％エタノールでpetをリンスする。
１５krpm、４℃、１〜５min（時間は気分次第）
supをデカントで出来るだけ捨てる。
１５krpm、４℃、一瞬
supをピッペットマンで捨てる。
バキュームドライ 1min（petが乾燥すればよい。エタノールが残っていると制限酵素で切ったときに切れ残りが生じる。）
petを５０ulのTE（１mg/l RNase入り）に溶解する。（mini-prepDNAを溶かすため専用のRNase入りのTEを作っている。このTEを使うことによって、制限酵素で切る度に反応溶液にRNaseを入れる必要がなくなる。RNaseが入っているからといってTEを低温に置いておく必要はないが、あまりに古くなる（数カ月は大丈夫）とRNaseの効き目が悪くなることがある。）
通常、１００ng/ul（X ５０ul)のプラスミドが回収できる。
以下のように混ぜる。
10 X Buffer 4 ul （使う酵素に応じて変える） DNA 2 ul Enzyme 0.5 ul （全体量の1/20を超えないようにする） Water To 40 ul
３７℃、３０分〜overnight（通常、water bathで２時間以上行っている） subcloning用vectorを作製する場合には、切断後、（H Bufferを使っているのであれば）サンプルにCIAPを0.5 ul加え、さらに３７℃、３０分。
TAKARAの10 X Loading bufferを8 ul加え、20 ulを電気泳動する（applyの際に沈まないと困るので、いつも1/5量くらい加える）。 残りはミスした時に備えて、残しておく。 subcloning用vectorを作製する場合には、近接した２レーンに全量を泳動する（その他の注意点は「切り出し」のファイルを見て）。
違う10 X Bufferで切断しないといけない場合は、次のいくつかの方法で行う。
ただし、enzymeによってはある条件で非特異的な切断が起こってしまうので、気をつけないといけない（カタログなどを確認すること）。
制限処理したプラスミドを電気泳動し、予想した断片がでているか確認する。
マシーンでMini-prepしたものをそのまま使っても、かなり（500bpくらい）読むことができるので、QIAEXIIで精製する必要はそれほどない。
DNA濃度は、電気泳動した際に同じような濃さのバンドであれば、１サンプルのみ検定すれば良い。
あとは、キットの説明書に従って行う。