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Genomic DNA miniprep

yamasaki y.: 2001.

Introduction

ハエから少量のゲノム DNA を抽出する。用途は Genomic PCR、Inverse PCR、Plasmid rescue 等。

Materials

Supplies and Equipment

  1. disposable tissue grinder (Kontes)

Solutions and Reagents

  1. BCL buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl2, 0.32 M Sucrose, 1% Triton X-100)
  2. 20mg/ml Proteinase K
  3. 10% SDS
  4. PCI (Phenol:Chloroform:Isopropylalcohol = 25:24:1)
  5. Chloroform or CIAA
  6. 100% EtOH, 70% EtOH
  7. TE

Method

  1. ハエ成虫を麻酔する。解剖皿に移し 100% EtOH で洗浄。風乾する。

  2. 1-4 匹を disposable tissue grinder に移す。

  3. 氷上で 50 ul の BCL B. を加え、すりつぶす。

  4. 氷上でさらに BCL B. を 150 ul 加え、クチクラが残っているだけになるまでよくすりつぶす。

  5. 1 ul の 20mg/ml proteinase K を加え混ぜる。

  6. 室温に戻し 10 ul の 10% SDS を加える。70'C で 60 分保温。

  7. 8 krpm, 2 min, @RT。

  8. 上清を新しいチューブに移す。

  9. PCI を等量 (200ul) 加え、混ぜる。

  10. 15 krpm, 30 min, @RT。

  11. 界面にタンパク質が tight な層を作ればよい。汚ければ繰り返す。

  12. 水層を新しいマイクロチューブに移し Chloroform を等量加え、混ぜる。

  13. 15 krpm, 20 min, @RT。

  14. 水層を新しいマイクロチューブに移し、1/10 量の 3 M NaOAc を加え混ぜる。

  15. 2.5 倍量の EtOH を加え混ぜる。

  16. 15 krpm, 10 min, @4'C。

  17. 上清を捨て、70 % EtOH でリンス。風乾。

  18. 30 ul TE に溶解。

  19. -20'C で保存。

Tips and Comments

  1. 発生ステージは成虫に限らない。
  2. Genomic PCR には 7ul を用いている。