Competent cellの作製

Yagi Y.: 2011.04.04

Fusion protein, transgenic などの Plasmid construction に応用する。

溶液の調整

2xYT: bact-tryptone 1.6g, yeast extract 1g, NaCl 0.5g 5N NaOH 50μL / 100mL
オートクレーブ滅菌

TB: PIPES 0.3g, CaCl2・2H20 0.22g, KCl 1.86g /100mL
PH を調整する。 KOH で 6.7にする。
MnCL4・H2O 1.09gを加え
フィルター滅菌 (0.22μm)後 4℃保存

操作

大腸菌をLBプレートに白金耳などでまく。（XL-1Bなどではtetを加えておく）
37℃で培養し、大きなコロニーを数個拾い、3-4mLの培養液で37℃一晩培養する。

1mLの培養液を100mLの2xYTに加え、室温（約25℃）で12時間培養する。
氷上に10分置く。
3-5,000rpmで10分4℃で遠心
上清を捨て、33.3mLの氷上で冷やされたTBを加える。
懸濁し、氷上に10分置く。

3-5,000rpmで10分4℃で遠心
上清を捨て、8mLの氷上で冷やされたTBを加える。
懸濁し、氷上に10分置く。

0.6mLのDMSOを加える。
氷上に10分置く。

エッペンチューブに分注。（100μL /tube）
液体窒素で凍らせた後、-80℃に保存。

この方法で通常1x10[7-8]程度の効率の細胞ができ、普通のトランスフォーメーションに十分な効率のものが得られる。